[14. 4. 2008]
Nimpf

pdf/genom.08.pdf ab S. 20

Prokaryont (kein Zellkern), Eukaryont

durch Kompartmentalisierung bessere Steuerungsmoeglichkeit

Chromatin (faerbbar): DNA (20 % m) + Protein (80 % m)
(Spiralen, Faltungen)

DNA-Faden ohne Protein: 2 nm Dicke, 5 cm Laenge; Nukleus: d = 6 um

-> Chromosom: Faltungsprozess mittels Proteinen

Interphase zwischen Zellteilungen (metabolische Aufgaben, Transkription: quasilineare Form notwendig, keine Chromosomen!)

Chromosom in Metaphase durch Colchicin stoppbar (Spindelgift)

* Telomere: Endstabilisierung (5'GGGTTA3') (offene Enden wuerden ansonsten verkleben: wuerde Chromosomenbildung verhindern!); Primer (Verlust einiger bp bei Replikation): Telomerase (in Stammzellen aktiv, in Hautfibroblasten (40 - 50 Teilungen bis zur Seneszenz) kaum) - in Krebszellen fast immer aktiv!

Telomerase: RNA -> cf. reverse Transkriptase! bei allen Eukaryonten

Mensch: bis 1000 "tandem repeats" GGGTTA
* Zentromere: bei Menschen alphoid DNA, mehrere Mbp repetitiver Bloecke (Anheftung an Spindelapparat)

Endversiegelung: 
* Haarnadelstruktur (Heterochromatin)
* t-Schleife (t loop) 3'-Ende mit 5'-Ende hybridisiert

Zellteilung:
* Verlust von 50 - 1000 Telomernukleotiden
* Seneszenz, wenn Telomere verbraucht sind
* durch Telomereinfuehrung Wiederaufnahme der Teilung
Alpha-Satelliten (Zentromere): 
* keine Information
* AT-reich

Chromosomenanalyse: 
* Faerbung mit Giemsa/Trypsinvorbehandlung -> Banden 
* dunkle G-Banden mit niedrigem GC-Gehalt, hochkondensiert, spaeter repliziert als Euchromatin
* helle R-Banden mit hoeherem GC-Gehalt: viele aktiv transkribierte Gene, in I weniger kondensiert
* duenne banden > 1E6 bp

Euchromatin (hell, GC, R)
Heterochromatin (dunkel, AT, G)
* f: 1 X-Chromosom inaktiviert -> dunkel!
* Centromere, Telomere

Gentherapie: Gene in heterochromatischen Regionen weniger - oder Inaktiv

M-FISH (multi color fluorescence in situ hybridization)

Karyotyp == Darstellung aller 46 Chromosomen in Mitose (Interphase: amorphe Masse mit Farbflecken)

Danturierung und Hybridisierung mit markierten DNA-Straengen bekannter Gene

[16. 4. 2008]
Zellteilung:
4n

Histone: bilden Proteinbausteine, auf denen DNA aufgewickelt ist (Grossteil d. 80 % Protein in Chromosomen)

Regulation der Bindungsstabilitaet DNA-Histon (Genregulation)

Core + Linker = Nucleosome:

Histon-core + Zwischenstueck =~ 200 bp

* d(DNA) = 2 nm 
* d(Nucleosom) = 11 nm 
* Suprastrukturen: Verkuerzung d(Suprastrukuren) = 30 nm
* d(Schlaufen) = 300 nm
* Superschlaufen d = 700 nm
* Chromosom d = 1.4 um (1400 nm)

==Beispiel: Chromosom 22==
p: fast ausschliesslich dunkles Heterochromatin
q: auf 10 % 40 Gene (auf 1 % 4 Gene ...), davon groesstenteils nicht-codierende Introns

==Genaufbau==
regulatorische Sequenzen (TATA-Box, CCAAT-Box, ...) s. Block 2

STOP-Codon nur fuer Translation relevant!

faelschliche Intron-Codierung: durchschnittlich nach 50 - 60 bp STOP-Codon -> sinnlose Proteinsequenzen

* Anfang des Introns: GT, 
* Ende des Introns: AG 
* 11 bp in Intron: T oder C
* Ende des Exons: oft (C|A)AG
* Beginn eines Exons: oft G

Mutationen im Intron: problematisch, wenn Erkennungssequenz mutiert!

primaeres Transkript (ungesplicete mRNA): enthaelt bereits poly-A Schwanz
-> Splicing: mature mRNA

Gene unterschiedlicher Laenge:
* beta-Globin: 2000 bp (3 Exons)
* Gerinnungsfaktor 8: 200000 bp (26 Exons)
nicht immer proportional zur Proteingroesse!

==Definitionen==
* Gen: regulatorische Elemente, Introns, Exons
* Transkriptionseinheit: transkribierter Anteil des Gens (Introns/Exons)
* alternatives splicing
* reg. Sequ.

==Sequenzmotive==

TATA, CCAAT, ... Boxen

Genduplikation

Pseudogene: Sequenzen mit Aehnlichkeit zu exprimierten Sequenzen, durch Mutation inaktiv

alpha-, beta-Globine

Locus/Allele: Polymorphismen

[17. 4. 2008]

==Polymorphismus==
verschiedene Varianten eines Allels, von denen keines eine viel groessere Haeufigkeit hat als die anderen

Marker == Sequenzmotiv, nach Mendel'schen Gesetzen vererbt, meist polymorph
Beispiele:
* SNP == Single nucleotid polymorphism, Sonderfall: Entstehen einer Schneidestelle f. Restriktionsendonukleasen -> Southern Blot (Restriction Fragment Length Polymorphism == RFLP) -> 2 Allele
* Laengenpolymorphismus
** VNTR (var. number of tandem repeats) ~ 70 bp, Dutzende Wiederholungen
** SSR (Simple Sequence Repeats), 2 - 4 bp PCR-Detektierung (z. B. 10 - 15 TCTA-Repeats in versch. Allelen) -> viele versch. Allele (z. B. 50)

RFLP: Southern Blot (radioakt. Marker -> lange Belichtungszeit 2 d) oder PCR-Analyse (Ergebnis in Stunden)

VNTR-Analyse:
* mit Marker ausserhalb d. Repeat: Allelanalyse
* mit Marker inn. Repeat: genet. Fingerprint (wenn Repeats auch in vielen anderen Allelen d. Genoms Polymorphismen bewirken -> einige Dutzend Positionen analysierbar)

[18. 4. 2008]

==Auffinden krankheitsausloesender Gene==
RFLP (Schnittstellen)

Reduktionsteilungen: 1. meiot. Teilung Crossing-over statt centromerische Teilung

statistische Wahrscheinlichkeit fuer Trennung zweier genetischer loci proportional zur Distanz am Gen

linkage analyse

gen. Abstand: Einheit (Centi-)Morgan:
1 cM = Rekombinationswahrscheinlichkeit 1 % =~ 1E6 bp (CAVE: nicht alle Rekombinationen gleich wahrscheinlich, s. u. genetic map)

Optimal: 1. Verwandtschaftsgrad (z. B. Zentrum f. Genforschung Utah/SLC)
* Marker detektieren (Southern Blot/PCR)

==genetic map vs physical map==
gen. map: Rekombinationswahrscheinlichkeit, manche Bereiche des sequenzierten Genoms erscheinen dabei stark komprimiert (1 cM < 1E6 bp), andere gedehnt (1 cM > 1E6 bp)

(phys.: klonierung in yeast artificial chromosomes (YAC), Sequenzierung, Ueberlappende Segmente)

==funktionelle vs. positionelle Klonierung==

funtional cloning:
# disease
# function
# gene
# (map: optional)

positional cloning (z. B. CF)
# disease
# map
# gene
# (function: optional)

s. Block 8

==Regulatorproteine==
exponentielle Zelldifferenzierung bei gleichem Genom (3 RP - 8 Zelltypen)

==Quantitative Anlagen==
Blutdruck: zwei Loci -> 16 Kombinationen (aabb ~ BD 100, AABB ~ BD 140, Gaussverteilung dazwischen)

==genetische Praedisposition==

fuer viele Erkrankungen keine Mendel'sche Vererbung

komplexe Erkrankungen

==genetischer Hintergrund komplexer Anlagen/Stoerungen==
ueber Verwandtschaftsanalyse (genetische Identitaet):
* Onkel/Tante 25 % ident
* Eltern 50 % ident
* eineiige Zwillinge 100 % ident

Je hoeher die Wahrscheinlichkeiten der Verwandtschaft mit Erkrankungsrisiko uebereinstimmen, desto groesser der genetische Hintergrund